HCN- und CNG-Kanäle

Einleitung   Funktion   Struktur   Krankheiten

Einleitung

Ionenkanäle sind wassergefüllte Poren, die es Ionen ermöglichen, die Plasmamembran einer Zelle zu überqueren. Es gibt viele verschiedene Ionenkanäle, die sich in ihrer Ionenselektivität und in ihrem Aktivierungsmechanismus voneinander unterscheiden. Einige Ionenkanäle sind hochselektiv für bestimmte Ionensorten, beispielsweise für Na⁺, K⁺ oder Ca²⁺. Demgegenüber stehen die nicht selektiven Kationenkanäle, die zwischen verschiedenen Kationen nicht unterscheiden können und diese gleichermaßen gut transportieren. Eine große Ionenkanalfamilie wird durch das elektrische Potenzial der Zellmembran gesteuert, während andere Typen spezifische Liganden benötigen, um zu öffnen. In unserer Arbeitsgruppe erforschen wir zwei eng verwandte Familien von Ionenkanälen, die beide durch die Bindung von zyklischem Adenosinmonophosphat (cAMP) und zyklischem Guanosinmonophosphat (cGMP) gesteuert werden: Die zyklisch Nukleotid-gesteuerten Kanäle (cyclic nucleotide-gated channels; CNG-Kanäle) und die hyperpolarisationsaktivierten und zyklisch Nukleotid-gesteuerten Kanäle (hyperpolarization-activated and cyclic nucleotide-gated channels; HCN-Kanäle). CNG-Kanäle spielen bei der Erzeugung elektrischer Signale in Spermien und Sinneszellen eine wichtige Rolle. HCN-Kanäle sind an der Ausbildung rhythmischer Aktivität im Herzen und im Gehirn beteiligt, weswegen man sie auch Schrittmacherkanäle nennt.

CNG- und HCN-Kanäle besitzen trotz ihrer unterschiedlichen physiologischen Aufgaben eine sehr ähnliche Struktur mit ähnlichen Funktionsdomänen. Beide gehören zur großen Familie der spannungsabhängigen Ionenkanäle. CNG- und HCN-Kanäle leiten nur Kationen, allerdings mit unterschiedlicher Selektivität: CNG-Kanäle sind nicht selektive Kationenkanäle, die unter physiologischen Bedingungen einen Einstrom von Na⁺- und Ca²⁺-Ionen vermitteln. HCN-Kanäle sind für K⁺ stärker permeabel als für Na⁺, leiten jedoch unter physiologischen Bedingungen einen Na⁺-Einstrom. Die beiden Kanalfamilien unterscheiden sich auch in ihrer Spannungsabhängigkeit: CNG-Kanäle werden durch die Bindung zyklischer Nukleotide aktiviert und sind nur sehr schwach spannungsabhängig. HCN-Kanäle hingegen werden durch Hyperpolarisation der Membran geöffnet; ihr spannungsabhängiges Öffnungsverhalten wird dabei durch die Bindung zyklischer Nukleotide moduliert. Obwohl beide Kanalfamilien durch zyklische Nukleotide gesteuert werden, ist ihre Selektivität und Affinität für cAMP und cGMP sehr unterschiedlich: Die CNG-Kanäle der Säugetiere bevorzugen cGMP, während HCN-Kanäle stärker durch cAMP moduliert werden.

  

Funktion

Photorezeptoren

In der Retina von Vertebraten kommen zwei Arten von Photorezeptoren vor: Stäbchen und Zapfen (Abbildung 1(a)).

 

Die Stäbchen sind äußerst lichtempfindlich und können sogar einzelne Photonen detektieren. Sie ermöglichen das Sehen im Dämmerlicht und bei Nacht. Zapfen dagegen sind deutlich weniger lichtempfindlich und ermöglichen (bei ausreichenden Lichtverhältnissen) das Farbsehen.

Die Umwandlung von Licht in ein elektrisches Signal (Phototransduktion) findet in den Außensegmenten der Photorezeptoren statt. Hier findet man im Dunkeln eine relativ hohe Konzentration des Botenstoffmoleküls cGMP. Die CNG-Kanäle in der Plasmamembran der Außensegmente sind daher geöffnet und die Photorezeptormembran ist depolarisiert. Das Sehpigment Rhodopsin ist das lichtempfindliche Molekül der Photorezeptoren. Es befindet sich in hoher Dichte in den sogenannten Disks, das sind Einstülpungen der Photorezeptormembran. Viele solcher Disks sind übereinandergestapelt, was die Wahrscheinlichkeit, ein Photon zu absorbieren, erhöht. Die Absorption eines Photons führt zur Aktivierung des Rhodopsins. Dieses aktiviert daraufhin das Transducin, ein Protein aus der Klasse der trimeren G-Proteine. Transducin wiederum aktiviert eine Phosphodiesterase (PDE), was zur Hydrolyse des Botenstoffs cGMP zu 5'-GMP führt. Die cGMP-Konzentration im Außensegment sinkt und die CNG-Kanäle schließen. Die darauf folgende Hyperpolarisation der Zelle führt dazu, dass weniger Neurotransmitter an der Synapse ausgeschüttet werden; dies zeigt den nachgeschalteten Zellen in der Retina die Absorption von Photonen an.

HCN-Kanäle ermöglichen es den Sehzellen Lichtintensitäten über 3 bis 4 Größenordnungen zu verarbeiten: Ein Lichtreiz hyperpolarisiert zunächst den Photorezeptor. Die HCN-Kanäle öffnen und leiten einen depolarisierenden Einwärtsstrom. Dieser Strom wirkt der Hyperpolarisation entgegen und verhindert, dass das Signal schon bei geringen Lichtreizen sättigt.

Veröffentlichungen:

Sesti F., Eismann E., Kaupp U.B., Nizzari M., Torre V. „The multi-ion nature of the cGMP-gated channel from vertebrate rods. “ J. Physiol. 487 (1995) 17-36 

Wissinger B., Müller F., Weyand I., Schuffenhauer S., Thanos S., Kaupp U.B., Zrenner E. „Cloning, chromosomal localization and functional expression of the gene encoding the α-subunit of the cGMP-gated channel in human cone photoreceptors.“ Eur. J. Neurosci. 9 (1997) 2512-2521 

Weitz D., Zoche M., Müller F., Beyermann M., Körschen H.G., Kaupp U.B., Koch K.W. „Calmodulin controls the rod photoreceptor CNG channel through an unconventional binding site in the N-terminus of the beta-subunit.“ EMBO J. 17 (1998) 2273-2284 

Seifert R., Eismann E., Ludwig J., Baumann A., Kaupp U.B. „Molecular determinants of a Ca²⁺-binding site in the pore of cyclic nucleotide-gated channels: S5/S6 segments control affinity of intrapore glutamates.“ EMBO J. 18 (1999) 119-130 

Körschen H.G., Beyermann M., Müller F., Heck M., Vantler M., Koch K.W., Kellner R., Wolfrum U., Bode C., Hofmann K.P., Kaupp U.B. „Interaction of glutamic-acid-rich proteins with the cGMP signalling pathway in rod photoreceptors.“ Nature 400 (1999) 761-766 

Frings S., Hackos D.H., Dzeja C., Ohyama T., Hagen V., Kaupp U.B., Korenbrot J.I. „Determination of fractional calcium ion current in cyclic nucleotide-gated channels.“ Methods Enzymol. 315 (2000) 797-817   

Ohyama T., Hackos D.H., Frings S., Hagen V., Kaupp U.B., Korenbrot J.I. „Fraction of the dark current carried by Ca²⁺ through cGMP-gated ion channels of intact rod and cone photoreceptors.“ J. Gen. Physiol. 116 (2000) 735-754 

Higgins M.K., Weitz D., Warne T., Schertler G.F., Kaupp U.B. „Molecular architecture of a retinal cGMP-gated channel: the arrangement of the cytoplasmic domains.“ EMBO J. 21 (2002) 2087-2094 

Weitz D., Ficek N., Kremmer E., Bauer P.J., Kaupp U.B. „Subunit stoichiometry of the CNG channel of rod photoreceptors.“ Neuron 36 (2002) 881-889

  

Riechzellen

Das Riechepithel der Nase ist mit Riechzellen ausgekleidet, die lange Fortsätze, sogenannte Zilien, besitzen. Auf der Oberfläche dieser Zilien befinden sich die Rezeptoren für Duftstoffe.

 

Bindet ein Duftstoffmolekül an den Rezeptor (Abbildung 2), aktiviert dieser zunächst ein G-Protein (G_olf), das wiederum eine Adenylatzyklase aktiviert. Die Adenylatzyklase bildet cAMP aus ATP, und die cAMP-Konzentration steigt an. Als nächster Schritt öffnen cAMP-sensitive CNG-Kanäle und leiten einen erregenden Ca²⁺ und Na⁺-Strom. Schließlich wird ein Aktionspotenzial ausgelöst und über die langen Axone der Riechzellen direkt ins Gehirn geleitet.
Einen Geruch, dem wir ausgesetzt sind, können wir nach einiger Zeit nicht mehr wahrnehmen - wir „gewöhnen uns“ an den Geruch. Das „Verblassen“ des Geruchs nennt man Adaptation. Ca²⁺-Ionen spielen bei der Adaptation eine wichtige Rolle: Das eingeströmte Ca²⁺ bindet an ein kleines Ca²⁺-Bindeprotein, Calmodulin (CaM). Der Komplex aus Ca²⁺ und Calmodulin kann dann an CNG-Kanäle binden und erniedrigt deren cAMP-Affinität, so dass weniger CNG-Kanäle geöffnet sind. Außerdem aktiviert Ca²⁺/CaM eine Phosphodiesterase (PDE), die cAMP hydrolysiert und somit die cAMP-Konzentration senkt. Obwohl der Duftstoff die Rezeptoren noch besetzt, kann die Zelle nicht mehr reagieren, d.h. der Geruch wird nicht mehr wahrgenommen. Darüber hinaus tragen weitere Adaptationsmechanismen auf verschiedenen Stufen der Verarbeitung des Riechreizes im Gehirn zur Herabsetzung der Empfindlichkeit bei.

Veröffentlichungen:

Müller F., Bönigk W., Sesti F., Frings S. „Phosphorylation within a regulatory domain of mammalian olfactory cyclic nucleotide-gated channels increases ligand sensitivity.“ J. Neurosci. 18 (1998) 164-173 

Bönigk W., Bradley J., Müller F., Sesti F., Boekhoff I., Ronnett G.V., Kaupp U.B., Frings S. „The native rat olfactory cyclic nucleotide-gated channel is composed of three distinct subunits.“ J. Neurosci. 19 (1999) 5332-5347 

Meyer M.R., Angele A., Kremmer E., Kaupp U.B., Müller F. „A cGMP signaling pathway in a subset of olfactory sensory neurons.“ Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 97 (2000) 10595-10600 

Bradley J., Reuter D., Frings S. „Facilitation of calmodulin-mediated odor adaptation by cAMP-gated channel subunits.“ Science 294 (2001) 2176-2178   

Frings S. „Chemoelectrical signal transduction in olfactory sensory neurons of air-breathing vertebrates.“ Cell. Mol. Life Sci. 58 (2001) 510-519

 

Spermien

Spermien besitzen eine charakteristische Gestalt:

 

Sie bestehen aus einem Kopfteil, einem Mittelstück und einem beweglichen Schwanz (Flagellum) (Abbildung 3). Spermien dienen der Befruchtung einer weiblichen Eizelle. Auf dem Weg zur Eizelle wird das Spermium chemotaktisch von der Eizelle angelockt. Wie Sinneszellen besitzen auch Spermien HCN-Kanäle und CNG-Kanäle im Flagellum. Ein Modell der Aktivierung ist in Abbildung 4 dargestellt: Ein Lockstoff aktiviert eine Guanylatzyklase (GC), die cGMP synthetisiert. Die cGMP-Konzentration steigt an und führt zur Öffnung von K⁺-selektiven CNG-Kanälen, was eine Hyperpolarisation der Membran zur Folge hat. Diese Hyperpolarisation führt zur Öffnung von HCN- und spannungsabhängigen Ca²⁺-Kanälen (Ca_V-Kanälen) des LVA-Typs (low voltage activated = LVA), welche einen Einstrom von Na⁺ und Ca²⁺ vermitteln. Die Erhöhung der Ca²⁺-Konzentration im Flagellum ändert den Flagellenschlag und damit die Richtung der Schwimmbahn.

 

Veröffentlichungen: 

Weyand I., Godde M., Frings S., Weiner J., Müller F., Altenhofen W., Hatt H., Kaupp U.B. „Cloning and functional expression of a cyclic-nucleotide-gated channels from mammalian sperm.“ Nature 368 (1994) 859-863 

Gauss R., Seifert R., Kaupp U.B. „Molecular identification of a hyperpolarization-activated channel in sea urchin sperm.“ Nature 393 (1998) 583-587 

Kaupp U. B., Solzin J., Hildebrand E., Brown J.E., Helbig A., Hagen V., Beyermann M., Pampaloni F., Weyand I. „The signal flow and motor response controling chemotaxis of sea urchin sperm.“ Nat. Cell Biol. 5 (2003) 109-117 

Matsumoto M., Solzin J., Helbig A., Hagen V., Ueno S.-I., Kawase O., Maruyama Y., Ogiso M., Godde M., Minakata P. R., Kaupp U.B., Hoshi M., Weyand I. „A sperm-activating peptide controls a cGMP-signaling pathway in starfish sperm.“ Dev. Biol. 260 (2003) 314-324 

Solzin J., Helbig A., Van Q., Brown J. E., Hildebrand E., Weyand I., Kaupp U.B. „Revisiting the role of H⁺ in chemotactic signaling of sperm.“ J. Gen. Physiol. 124 (2004) 115-124 

Böhmer M. , Van Q., Weyand I., Hagen V., Beyermann M., Matsumoto M., Hoshi M., Hildebrand E., Kaupp U.B. „Ca²⁺ spikes in the flagellum control chemotactic behavior of sperm.“ EMBO J. 24 (2005) 2741-2752 

Strünker T., Weyand I., Bönigk W., Van Q., Loogen A., Brown J. E., Kashikar N., Hagen V., Krause E., Kaupp U.B. „A K⁺-selective cGMP-gated ion channel controls chemosensation of sperm.“ Nat. Cell Biol. 8 (2006) 1149-1154

   

Herzzellen

Das Herz ist ein Muskel, der durch rhythmische Kontraktion den Körper mit Blut versorgt. Der Herzschlag wird durch elektrische Aktivität im Sinusknoten ausgelöst. Der Sinusknoten besteht aus Muskelzellen, die spontan elektrisch aktiv sind und Aktionspotenziale erzeugen, die man Schrittmacherpotenziale nennt. Die elektrische Erregung im Sinusknoten breitet sich über das gesamte Herz aus. Die Ausbildung eines Aktionspotenzials im Sinusknoten hängt vom Zusammenspiel verschiedener Ionenkanäle ab (Abbildung 5).

 

Ein Aktionspotenzial wird ausgelöst, wenn ein bestimmter Schwellenwert des Membranpotenzials überschritten wird. Die Öffnung spannungsabhängiger Ca_V-Kanäle führt zu einem Ca²⁺-Einwärtsstom, was zur Ausbildung eines Aktionspotenzials führt. Etwas später öffnen spannungsabhängige K⁺-Kanäle, die einen K⁺-Auswärtsstrom vermitteln und zunächst die Zelle repolarisieren und anschließend sogar hyperpolarisieren. Hierdurch öffnen die spannungsabhängigen HCN-Kanäle, die einen Na⁺-Einwärtsstrom tragen, der die Membran langsam depolarisiert, bis der Schwellenwert erneut erreicht wird.

 

Veröffentlichungen:

Seifert R., Scholten A., Gauss R., Mincheva A., Lichter P., Kaupp U.B. „Molecular characterization of a slowly gating human hyperpolarization-activated channel predominantly expressed in thalamus, heart, and testis.“ Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 96 (1999) 9391-9396 

Schulze-Bahr E., Neu A., Friederich P., Kaupp U.B., Breithardt G., Pongs O., Isbrandt D. „Pacemaker channel dysfunction in a patient with sinus node disease.“ J. Clin. Invest. 111 (2003) 1537-1545 

Harzheim D., Pfeiffer K.H., Fabritz L., Kremmer E., Buch T., Waisman A., Kirchhof P., Kaupp U.B., Seifert R. „Cardiac pacemaker function of HCN4 channels in mice is confined to embryonic development and requires cyclic AMP.“ EMBO J. 27 (2008) 692-703

  

Struktur

Viele Ionenkanäle sind aus mehreren Untereinheiten aufgebaut. Alle Mitglieder der Familie spannungsabhängiger Kaliumkanäle, zu denen die CNG- und HCN-Kanäle gehören, werden aus vier Untereinheiten gebildet, die sich um eine zentrale Pore anordnen. Jede Untereinheit besteht aus sechs transmembranalen Segmenten (S1 bis S6). Die Pore wird durch einen Bereich gebildet, der zwischen den Segmenten S5 und S6 liegt. Dieser Bereich erinnert an das Selektivitätsfilter der K⁺-Kanäle.

 

Das S4-Segment der CNG- und HCN-Kanäle hat an jeder dritten Position der Primärstruktur eine positiv geladene Aminosäure, Lysin oder Arginin, und ähnelt dem Spannungsfühler in spannungsabhängigen Kanälen. Die geladenen Aminosäuren des S4-Motivs sind in die Membran eingebaut und können das elektrische Feld, das in der Membran vorherrscht „messen“. Ändert sich das Membranpotenzial, ändern die geladenen Aminosäuren ihre Positionen im elektrischen Feld und lösen dadurch eine Konformationsänderung im Protein aus. Der Kanal öffnet. HCN-Kanäle sind, im Gegensatz zu CNG-Kanälen, stark spannungsabhängig. Die Funktion des S4-Segments bei CNG-Kanälen ist bis heute unklar. An die transmembranale Domäne S6 schließt sich der sogenannte C-Linker an. Aus Mutationsstudien weiß man, dass dieser Teil des Kanals eine wichtige Rolle beim Schalten, dem so genannten „gating“, des Ionenkanals spielt. Nach dem C-Linker folgt die Bindestelle für zyklische Nukleotide (CNBD). Die Bindung von zyklischen Nukleotiden ändert die Konformation dieser Domäne; dadurch erhöht sich die Offenwahrscheinlichkeit des Kanals. Wie dies genau funktioniert, wird von uns untersucht. Welche Struktur übersetzt das Bindungsereignis in einen anderen Öffnungszustand? Wie interagieren die einzelnen Untereinheiten miteinander? Wie viele Untereinheiten müssen mit einem Liganden besetzt sein, damit der Kanal öffnet?

 

Aufbau der CNG-Kanäle

Native CNG-Kanäle sind Heterotetramere. Es sind sechs verschiedene Untereinheiten identifiziert worden, die in zwei Familien, CNGA und CNGB, fallen. Die vier CNGA-Untereinheiten können, abgesehen von der CNGA4-Untereinheit, funktionelle homotetramere Kanäle bilden. Die CNGA4-Untereinheit scheint eher einer eigenen Familie anzugehören, wird aber aufgrund der Sequenzähnlichkeit und ähnlicher Strukturmotive den CNGA-Untereinheiten zugeordnet. Die beiden CNGB-Untereinheiten, CNGB1 und CNGB3, sind regulatorische Untereinheiten, die in verschiedenen Spleißvarianten vorkommen. Werden die CNGA-Untereinheiten mit den regulatorischen CNGB-Untereinheiten heterolog koexprimiert, entstehen Kanäle mit Eigenschaften, die sich von denen homomerer CNG-Kanäle in charakteristischer Weise unterscheiden. Zu den veränderten Eigenschaften gehören das Schaltverhalten, die Ligandensensitivität sowie die Liganden- und Ionenselektivität.

 

Die Zusammensetzung der CNG-Kanäle aus A und B Untereinheiten wurde durch den Vergleich der Eigenschaften heterolog exprimierter und nativer Kanäle aufgeklärt. Die Stöchiometrie dieser Kanalkomplexe wurde mit unterschiedlichen Methoden untersucht. Der Stäbchen-CNG-Kanal besteht aus drei CNGA1- und einer CNGB1-Untereinheit, der Zapfenkanal aus je zwei CNGA3- und CNGB3-Untereinheiten und der Riechzellenkanal aus zwei CNGA2- und je einer CNGA4- und CNGB1-Untereinheit.
Bis heute ist es nicht gelungen, die dreidimensionale Struktur eines CNG-Kanals mit atomarer Auflösung aufzuklären. Allerdings gelang es Higgins et al. (2002) die Struktur des CNG-Kanals aus Rindersehstäbchen durch Elektronen-Mikroskopie und Bildverarbeitung mit einer Auflösung von 35 Å zu beobachten (Abbildung 9).

 

Die Struktur zeigt drei unterschiedliche Domänen: Eine große, viereckige Domäne ist über zwei schmale Grate mit zwei kleineren Domänen verbunden. Die Dimensionen entsprechen denen anderer spannungsabhängiger Ionenkanäle. Higgins et al. schlagen vor, dass es sich bei der großen Domäne um den transmembranalen Teil des Kanals handelt, während die beiden kleineren Domänen Dimere der CNBDs darstellen. Diese hängen wie Gondeln unter dem porenbildenden Teil des Kanals. Auch die Schalteigenschaften des Kanals legen eine Quartärstruktur aus zwei funktionellen Dimeren nahe (Liu et al., 1998). Ob dies ein generelles Struktur- und Funktionsprinzip von CNG-Kanälen ist, kann nur durch Strukturen mit besserer Auflösung geklärt werden.

  

Aufbau der Bindestelle für zyklische Nukleotide (CNBD) und des C-Linkers

Die CNBD besteht aus 80-120 Aminosäuren und ist ein Strukturmotiv, das in CNG- und HCN-Kanälen, aber auch in der Proteinkinase A (PKA) oder dem „catabolic activator protein“ (CAP) gefunden wird (Abbildung 10).

 

Die Bindestelle besteht aus vier α-Helizes (A, P, B und C) und acht β-Faltblättern (β1- β8). Die β-Faltblätter bilden ein abgeflachtes Fass, das aus zwei antiparallelen Schichten mit jeweils vier β-Faltblättern besteht. N-terminal werden die β Faltblätter von der A-Helix und C-terminal von der B- und C-Helix flankiert. Zwischen dem sechsten und siebten β-Faltblatt befindet sich die kurze P-Helix. Die zyklischen Nukleotide binden an eine konservierte Region der CNBD, die so genannte „phosphate binding cassette“ (PBC), die von den β-Faltblättern, der P-Helix und der C-Helix gesäumt wird.
In CNG- und HCN-Kanälen verbindet der 80 Aminosäuren lange C-Linker die CNBD mit dem transmembranalen Segment S6. Zagotta et al. (2003) lösten die Struktur der CNBD mit C-Linker eines HCN2-Kanals (mHCN2).
Sowohl cAMP als auch cGMP können an die CNBD binden. Die beiden Liganden unterscheiden sich jedoch in der Bindungskonfiguration. Das cAMP bindet in der anti-Konfiguration, cGMP in der syn-Konfiguration. Die Kristallstruktur zeigt zudem wichtige Wechselwirkungen, die zwischen den zyklischen Nukleotiden und dem Protein existieren: Das Phosphat und der Ribosering des zyklischen Nukleotids interagieren durch Wasserstoffbrückenbindungen und elektrostatische Wechselwirkungen mit der β-Fassstruktur und der P-Helix. Der Purinring interagiert über Wasserstoffbrücken-Bindungen und hydrophobe Wechselwirkungen mit Aminosäuren im vierten und fünften β-Faltblatt und in der C-Helix.

 

Der C-Linker besteht aus sechs α-Helizes (A´-F´; Abbildung 11). Die ersten beiden Helizes (A´ und B´) bilden ein „Helix-Turn-Helix“ Motiv, das mit den C´- und D´-Helizes der jeweils benachbarten Untereinheit interagiert. Die A´- und B´-Helizes einer Untereinheit ruhen wie ein „Ellenbogen“ auf den C´- und D´-Helizes der benachbarten Untereinheit, der „Schulter“. „Ellenbogen“ und „Schulter“ interagieren über Wasserstoffbrückenbindungen, hydrophobe Wechselwirkungen und Salzbrücken miteinander. Abbildung 12 zeigt die intermolekularen Wechselwirkungen zwischen den C-Linkern benachbarter Untereinheiten. Fast alle intermolekularen Wechselwirkungen finden zwischen den Aminosäuren der C-Linker statt. Daher wird vermutet, dass der C-Linker beim Schalten eine wichtige Rolle spielt.

 

Der CNG-Kanal aus Mesorhizobium loti

Das erste Gen, das für einen prokaryotischen zyklisch Nukleotid-sensitiven Ionenkanal (MlCNG) kodiert, wurde 2004 aus dem Bodenbakterium Mesorhizobium loti (M. loti) kloniert. Der Kanal weist alle typischen Merkmale von Säugetier-CNG-Kanälen auf: Eine Untereinheit hat sechs transmembranale Segmente, eine Porenregion zwischen S5 und S6 und eine C-terminale Bindestelle für zyklische Nukleotide. Der MlCNG-Kanal konnte funktionell rekonstituiert werden und zeigte Kanalaktivität, die von der Konzentration zyklischer Nukleotide abhing. Da sich das Protein zusätzlich in großen Mengen heterolog exprimieren lässt, scheint es ein ideales Modellsystem zu sein, um CNG-Kanäle besser zu verstehen. Die Struktur der isolierten Bindestelle wurde von Clayton et al. (2004) in der ligandengebundenen Form aufgeklärt. Zusätzlich gelang es, die Struktur einer ligandenfreien Mutante (R348A) der CNBD zu lösen. Es wurde die typische CNBD-Faltung beobachtet.

 

Durch Mutationsstudien konnten wir zeigen, dass die Aminosäure R348 (C-Helix) entscheidend für eine hohe Ligandenaffinität ist. Während cAMP und cGMP mit submikromolaren Konzentrationen an die Wildtyp-CNBD binden (K_D,cAMP = 70-110 nM; K_D,cGMP = 300-500 nM), sind die K_D-Werte der R348A-Mutante zu höheren Werten verschoben (K_D,cAMP = 18,5 μM; K_D,cGMP = 22,3 μM). Dabei unterscheiden sich die Affinitäten des vollständigen Kanals nicht von denen der isolierten CNBD.
Die Ergebnisse sind aus zwei Gründen bemerkenswert. Zum einen ist die Affinität für cAMP größer als für cGMP. Dies wird normalerweise für HCN und nicht für CNG-Kanäle beobachtet. Zum anderen ist es überraschend, dass kein Unterschied in den Affinitäten des vollständigen MlCNG-Kanals und der isolierten CNBD beobachtet wurde. Dies ist deswegen so interessant, weil man bisher davon ausgegangen ist, dass ein Teil der Bindungsenergie in den Schaltvorgang investiert wird und daher die Affinität des gesamten Kanals gegenüber der isolierten Bindestelle verringert wird. Außerdem erwartet man, dass Bindestellen oder Untereinheiten die in einem tetrameren Kanals interagieren eine andere Struktur und damit Affinität aufweisen. Aus dem Ergebnis muss man schließen, dass die Bindestellen unabhängig voneinander sind.

Veröffentlichungen:

Bönigk W., Bradley J., Müller F., Sesti F., Boekhoff I., Ronnett G.V., Kaupp U.B., Frings S. „The native rat olfactory cyclic nucleotide-gated channel is composed of three distinct subunits.“ J. Neurosci. 19 (1999) 5332-5347

Bönigk W., Altenhofen W., Müller F., Dose A., Illing M., Molday R.S., Kaupp U.B. „Rod and cone photoreceptor cells express distinct genes for cGMP- gated channels.“ Neuron 10 (1993) 865-877  

Bönigk W., Müller F., Middendorff R., Weyand I., Kaupp U.B. „Two alternatively spliced forms of the cGMP-gated channel alpha -subunit from cone photoreceptor are expressed in the chick pineal organ.“ J. Neurosci. 16 (1996) 7458-7468  

Clayton G., Silverman W., Heginbotham L., Morais-Cabral J. „Structural basis of ligand activation in a cyclic nucleotide regulated potassium channel.“ Cell 119 (2004) 615-627  

Cook N.J., Molday L.L., Reid D., Kaupp U.B., Molday R.S. „The cGMP-gated channel of bovine rod photoreceptors is localized exclusively in the plasma membrane.“ J. Biol. Chem. 264 (1989) 6996-6999 

Cukkemane A., Grüter B., Novak K., Gensch T., Bönigk W., Gerharz T., Kaupp U.B., Seifert R. „Subunits act independently in a cyclic nucleotide-activated K⁺ channel.“ EMBO J. (2007) 749-755  

Henn D.K., Baumann A., Kaupp U.B. „Probing the transmembrane topology of cyclic nucleotide-gated ion channels with a gene fusion approach.“ Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 92 (1995) 7425-7429  

Higgins M.K., Weitz D., Warne T., Schertler G.F., Kaupp U.B. „Molecular architecture of a retinal cGMP-gated channel: the arrangement of the cytoplasmic domains.“ EMBO J. 21 (2002) 2087-2094  

Kaupp U.B. und Seifert R. „Cyclic nucleotide-gated ion channels.“ Physiol. Rev. 82 (2002) 769-824  

Kaupp U.B. und Seifert R. „Molecular diversity of pacemaker ion channels.“ Annu. Rev. Physiol. 63 (2001) 235-257  

Koch K.W. und Kaupp U.B. „Cyclic GMP directly regulates a cation conductance in membranes of bovine rods by a cooperative mechanism.“ J. Biol. Chem. 260 (1985) 6788-6800  

Liu D., Tibbs G., Paolett, P., Siegelbaum S. „Constraining ligand-binding site stoichiometry suggests that a cyclic nucleotide–gated channel is composed of two functional dimers.“ Neuron 21 (1998) 235-248  

Körschen H. G., Illing M., Seifert R., Sesti F., Williams A., Gotzes S., Colville C., Müller F., Dose A., Godde M. „A 240 kDa protein represents the complete β subunit of the cyclic nucleotide-gated channel from rod photoreceptor.“ Neuron 15 (1995) 627-636  

Meyer M.R., Angele A., Kremmer E., Kaupp U.B., Müller F. „A cGMP-signaling pathway in a subset of olfactory sensory neurons.“ Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 97 (2000) 10595-10600  

Molday R.S., Molday L.L., Dosé A., Clark-Lewis I., Illing M., Cook N.J., Eismann E., Kaupp U.B. „The cGMP-gated channel of the rod photoreceptor cell. Characterization and orientation of the amino terminus.“ J. Biol. Chem. 266 (1991) 21917-21922  

Müller F., Bönigk W., Sesti F., Frings S. „Phosphorylation within a regulatory domain of mammalian olfactory cyclic nucleotide-gated channels increases ligand sensitivity.“ J. Neurosci. 18 (1998) 164-173  

Müller F., Vantler M., Weitz D., Eismann E., Zoche M., Koch K.W., Kaupp U.B. „Ligand sensitivity of the α2-subunit from the bovine cone cGMP-gated channel is modulated by protein kinase C but not by calmodulin.“ J. Physiol. (Lond.) 532 (2001) 399-409  

Stevens D.R., Seifert R., Bufe B., Müller F., Kremmer E., Gauß R., Meyerhof W., Kaupp U.B., Lindemann B. „The hyperpolarization-activated channels HCN1 and 4 mediate reponses to sour stimuli.“ Nature 413 (2001) 631-635  

Weitz D., Ficek N., Kremmer E., Bauer P.J., Kaupp U.B. „Subunit stoichiometry of the CNG channel of rod photoreceptors.“ Neuron 36 (2002) 881-889  

Weitz D., Zoche M., Müller F., Beyermann M., Körschen H.G., Kaupp U.B., Koch K.W. „Calmodulin controls the rod photoreceptor CNG channel through an unconventional binding site in the N-terminus of the beta-subunit.“ EMBO J. 17 (1998) 2273-2284  

Weyand I., Godde M., Frings S., Weiner J., Müller F., Altenhofen W., Hatt H., Kaupp U.B. „Cloning and functional expression of a cyclic-nucleotide-gated channel from mammalian sperm.“ Nature 368 (1994) 859-863

Zagotta W.N., Olivier N.B., Black K.D., Young, E.C., Olson R., Gouaux E. „Structural basis for modulation and agonist specificity of HCN pacemaker channels.“ Nature 425 (2003) 200-205

  

Krankheiten

Farbenblindheit

Stäbchen und Zapfen erfüllen unterschiedliche Aufgaben in der Retina: Während die Stäbchen sehr lichtempfindlich sind und das Sehen bei schwachem Licht ermöglichen, sind die Zapfen deutlich weniger lichtempfindlich und ermöglichen das Farbsehen. In der menschlichen Retina kommen drei Typen von Zapfen vor, die jeweils für kurz-, mittel- oder langwelliges Licht empfindlich sind.Menschen, die keine Farben wahrnehmen können, leiden unter Farbenblindheit (Achromatopsie). Achromatopsie ist entweder genetisch bedingt (angeborene Achromatopsie), oder sie kann durch eine neurologische Störung als Folge einer Verletzung des visuellen Cortex (Sehrinde), z.B. durch einen Schlaganfall oder ein Schädel-Hirn-Trauma, hervorgerufen werden (cerebrale Achromatopsie). Angeborene Achromatopsie ist eine seltene, autosomal-rezessive Erbkrankheit, die bei einem von etwa 20.000 Menschen auftritt. Die betroffenen Menschen (Achromaten) leiden zudem unter Photophobie (Überempfindlichkeit gegenüber Licht), Nystagmus („Augenzittern“) und einer verminderten Sehschärfe. Genetische Untersuchungen haben gezeigt, dass bei der angeborenen Achromatopsie die Funktion der Zapfen beeinträchtigt ist. Bei Achromaten funktionieren also nur noch die lichtempfindlichen Stäbchen.  Deshalb leiden Achromaten bei hellem Tageslicht unter „Tagblindheit“ und können nur noch ein nebliges Weiß oder Grau wahrnehmen, da die Stäbchen durch die starke Lichteinstrahlung völlig überlastet sind. Am Punkt des schärfsten Sehens, dem sogenannten „Gelben Fleck“ in der Mitte der Retina, befinden sich ausschließlich Zapfen und keine Stäbchen. Achromaten haben deshalb am Ort des schärfsten Sehens gar keine funktionellen Photorezeptoren und besitzen daher eine verringerte Sehschärfe. Dies führt bei den Betroffenen zum Nystagmus, einem unwillkürlichen Augenzittern.Die meisten Fälle angeborener Achromatopsie sind auf Mutationen in Genen zurückzuführen, die für Untereinheiten des Zapfen-CNG-Kanals kodieren. Etwa 40-50 % der Achromaten besitzen eine Mutation im CNGB3-Gen, 20-30 % eine Mutation im CNGA3-Gen. In einer großen Studie konnten zahlreiche Mutationen im CNGA3-Gen molekular identifiziert werden: Die Mutationen liegen im N-Terminus in der Nähe des transmembranalen Segmentes S1, im S4 Motiv, im C-Linker, und in der cGMP-Bindedomäne (Abbildung 14). Bei den meisten dieser Mutationen handelt es sich um Aminosäureaustausche. Im CNGB3-Gen wurden bisher weniger Mutationen gefunden (Abbildung 14), darunter Leserasterverschiebungen hervorgerufen durch kurze Deletionen und Stop-Codon-Mutationen.

 

Neben der vollständigen Achromatopsie gibt es auch Fälle, in denen das Farbensehen zwar stark beeinträchtigt ist, aber nicht völlig fehlt (unvollständige Achromatopsie) (Abbildung 15).

 

 

In Kooperation mit Arbeitsgruppen der Universität Tübingen haben wir die molekulare Grundlage der unvollständigen Achromatopsie an zwei Schwestern untersucht, die zwei heterozygote CNGA3-Mutationen tragen. Psychophysikalische und elektroretinographische Untersuchungen zeigen, dass die Lichtempfindlichkeit des Zapfensystems herabgesetzt ist, und dass die Signalweiterleitung von Zapfen zu nachfolgenden Neuronen gestört ist. Jede der Schwestern trägt zwei veränderte CNGA3-Allele, eines vom Vater und eines von der Mutter. Die beiden mutanten Allele kodieren für zwei unterschiedliche CNGA3-Kanaluntereinheiten: Bei Allel 1 ist die Aminosäure 224 von Threonin zu Arginin mutiert (T224R), während bei Allel 2 die Aminosäure 369 von Threonin zu Serin mutiert ist (T369S) (Abbildung 16).

 

Nur eine der beiden Kanalmutanten bildet funktionelle Kanäle, die jedoch im Vergleich zu Wildtypkanälen andere Eigenschaften haben. Dazu gehört eine geringere Blockierung durch Ca²⁺ negativen Membranpotenzialen in Folge einer erhöhten Ca²⁺-Leitfähigkeit. Überraschenderweise können fast alle veränderten Kanaleigenschaften durch die Koexpression des mutanten CNGA3-Allels mit einer Wildtyp-CNGB3-Untereinheit aufgehoben werden - mit Ausnahme der Ca²⁺-Permeabilität. Wir vermuten deshalb, dass die Änderung der Ca²⁺-Permeabilität der Zapfen-CNG-Kanäle für die phänotypischen Eigenschaften der unvollständigen Achromatopsie (Verminderung der Lichtempfindlichkeit und Störung der synaptischen Transmission) verantwortlich ist.

Veröffentlichung:

Tränkner D., Jägle H., Kohl S., Apfelstedt-Sylla E., Sharpe L.T., Kaupp U.B., Zrenner E., Seifert R., Wissinger B. „Molecular basis of an inherited form of incomplete achromatopsia.“ J. Neurosci. 24 (2004) 138-147

  

Funktionsstörungen des Sinusknotens

Der Sinusknoten ist der primäre Schrittmacher des Herzschlags. Er besteht aus einer Gruppe von spezialisierten Herzmuskelzellen, die in der Lage sind spontan zu depolarisieren und so rhythmisch elektrisch aktiv zu sein. Eine Funktionsstörung des Sinusknotens (sinus node disease = SND) äußert sich in Form von Herzrhythmusstörungen: Das Herz schlägt entweder zu langsam (Bradykardie) oder zu schnell (Tachykardie). Oft kommt es im Verlauf einer Herzerkrankung oder nach einem operativen Eingriff am Herzen zu einer SND, jedoch ist in anderen Fällen der Grund der SND nicht klar ersichtlich (idiopathische SND). In Kooperation mit Arbeitsgruppen der Universitäten Münster und Hamburg haben wir eine Mutation in einem HCN-Gen bei einer Patientin entdeckt, die an idiopathischer SND leidet. Bei der Mutation handelt es sich um eine kleine Deletion in Exon 5 des menschlichen HCN4-Gens, die zu einer Verschiebung des Leserasters führt. Die HCN4-Kanalmutante hat daher einen verkürzten Carboxy-Terminus, d.h. die Bindedomäne für zyklische Nukleotide fehlt. Die HCN4-Kanalmutante vermittelt wie der Wildtyp-Kanal einen hyperpolarisationsaktivierten Einwärtsstrom und besitzt eine dem Wildtypkanal sehr ähnliche Aktivierungskinetik und Spannung der halbmaximalen Aktivierung (V1/2). Im Gegensatz zum Wildtyp-Kanal ist die Mutante jedoch nicht durch cAMP modulierbar und hat einen dominant-negativen Effekt auf Wildtypkanäle: Bei Koexpression von Mutante und Wildtyp verhält sich jeder Kanal, der mindestens eine mutierte Untereinheit enthält, wie ein mutanter Kanal, selbst wenn Wildtyp-Untereinheiten vorhanden sind.Die Modulation des HCN4-Kanals durch cAMP ist physiologisch wichtig: Der Sinusknoten steht unter dem Einfluss des vegetativen Nervensystems und unterliegt einer hormonellen Kontrolle. Durch die Aktivität des Sympathikus wird der Neurotransmitter Noradrenalin freigesetzt, was zu einer Erhöhung des Herzschlags führt. Denselben Effekt haben die Hormone Arenalin und Noradrenalin, die von der Nebenniere ausgeschüttet werden. Adrenalin und Noradrenalin aktivieren in den Zellen des Sinusknotens über den β-adrenergen Rezeptor und eine G-Protein-vermittelte Signalkaskade eine Adenylatzyklase und führen somit zu einer Erhöhung der intrazellulären cAMP-Konzentration. Die erhöhte cAMP-Konzentration verschiebt die Aktivierungskurve von HCN-Kanälen zu positiveren Membranspannungen und erhöht die HCN-Kanalaktivität.Die Untersuchung legt nahe, dass die SND der Patientin auf eine verringerte cAMP-Sensitivität der HCN4-Mutante zurückzuführen ist. Es ist wahrscheinlich, dass auch andere Fälle „idiopathischer“ SNDs auf Mutationen in HCN-Genen zurückzuführen sind.

 

Veröffentlichung:

Schulze-Bahr E., Neu A., Friederich P., Kaupp U.B., Breithardt G., Pongs O., Isbrandt D. „Pacemaker channel dysfunction in a patient with sinus node disease.“ J. Clin. Invest. 111 (2003) 1537-1545