Schalten von Nervenzellen mit Licht - eine neue Methode in der Epilepsieforschung

Einleitung
„Mausgehirnstecker“ – unser Konzept
Datenübertragung 
Der "Zylinder"
Ausblick

Einleitung

Mit Licht kann man die Aktivität von Nervenzellen an- und ausschalten. Damit beschäftigt sich das neue Gebiet der Optogenetik. Wir entwickeln eine Optoelektrodensonde (Projekt „Mausgehirnstecker“), mit der Nervenzellen im Mausgehirn optisch stimuliert und die daraus resultierenden elektrischen Signale gemessen werden können. Dafür setzen wir mikrotechnologische Sensoren ein und arbeiten mit telemetrischer Datenübertragung an lebenden Tieren. Ein Ziel ist es, die Mechanismen für neuronale Synchronisation und Krankheiten wie Epilepsie besser zu verstehen.

Grundlage für die Optogenetik war die Entdeckung von lichtabhängigen Ionenkanälen, den Channelrhodopsinen, in den Jahren 2002/2003 durch Ernst Bamberg, Direktor am Max-Planck-Institut für Biophysik in Frankfurt, Georg Nagel, Universität Würzburg und Peter Hegemann, Humboldt-Universität Berlin. Die Wissenschaftler fanden die Channelrhodopsine erstmals in einer einzelligen Grünalge; sie spielen dort eine wichtige Rolle bei der Phototaxis, also der Bewegungssteuerung der Alge in Richtung einer Lichtquelle oder von ihr weg. Channelrhodopsine lassen sich auch in andere erregbare Zellen wie z. B. Nervenzellen einführen, wodurch eine gezielte Stimulation der Zellen ermöglicht wird [1,2,3,4,5,6]. Diese „Photostimulation“ ist sowohl in Zellkulturen (in vitro) als auch am lebenden Tier (in vivo) möglich. In Nervenzellen etwa können auf diese Weise Ionenkanäle mit Licht einer Wellenlänge von ca. 480 nm (blau) geöffnet werden; die Nervenzelle wird „angeschaltet“. Entsprechend bewirkt das Protein Halorhodopsin das Schließen der Ionenkanäle bei Wellenlängen von ca. 570 nm (gelb); die Nervenzelle wird „ausgeschaltet“. Es können mit dieser Technik aber nicht nur einzelne Nervenzellen, sondern ganze neuronale Netzwerke im Gehirn stimuliert werden - und das elektrodenfrei.

Das Hauptsymptom von Epilepsien sind wiederkehrende Anfälle, die zu einer neuronalen Schädigung und neurologischen Defiziten führen können. Ein epileptischer Anfall wird auf zellulärer Ebene durch eine spontane, synchronisierte Entladung von großen Neuronengruppen ausgelöst. Ein Ziel der Epilepsieforschung ist, die Mechanismen für neuronale Synchronisation besser zu verstehen und dadurch neue Strategien zu entwickeln, um die Anfälle besser kontrollieren zu können. Die Komplexität der neuronalen Netzwerke im Gehirn erlaubt jedoch nur langsame Fortschritte im Verständnis dieser Synchronisationsprozesse [7,8,9,10]. Bisher verwendete, elektroden-basierte Stimulations- und Ableittechniken sind zur Analyse eines derartig komplexen Gewebes mit einer Vielzahl verschiedener Zelltypen und komplexen Verbindungen nur bedingt geeignet. Der Grund dafür ist, dass diese Techniken lediglich die Stimulation und Vermessung weniger Nervenzellen zulassen. Die neue, lichtbasierte Stimulationstechnik erlaubt hingegen die spezifische Anregung auch größerer Neuronenverbände.

In Kooperation mit Prof. Dr. Heinz Beck von der Bonner Klinik für Epileptologie soll ein solcher „Lichtschalter“ genutzt werden, um Epilepsie auf der Netzwerkebene besser zu verstehen. Es sollen transgene Mausgehirne optogenetisch stimuliert und die elektrischen Signale der Neuronen in vivo, d.h. am intakten Gehirn frei beweglicher Mäuse, gemessen werden. Wir hoffen, mit dieser Methode einen wesentlichen Fortschritt gegenüber den in vitro Untersuchungen an „in Scheibchen geschnittenen“ Gehirnen zu erzielen.

Folgende Frage scheint naheliegend: Kann man mit optogenetischen Methoden nicht auch kranke Nervenzellen im menschlichen Gehirn behandeln? So könnte man zum Beispiel im Gehirn von Epilepsie oder Parkinson-Patienten gezielt die anfallauslösenden Nervenzellareale mit Hilfe von lichtleitenden Glasfasern nach Bedarf kontrolliert „an- oder abschalten“, um den entsprechenden Krankheitsphänomene entgegen zu wirken, bevor der Patient dies merkt. Ob diese wissenschaftliche Vision jemals erreichbar sein wird, weiß man nicht. Zunächst wollen wir zeigen, dass eine optische Stimulation von Neuronen am lebenden Tier mit Signalmessung und telemetrischer Datenübertragung aus technologischer Sicht überhaupt möglich ist.

„Mausgehirnstecker“ – unser Konzept

Dieser technischen Herausforderung stellten wir uns im Rahmen des von BMBF geförderten Vorlaufprojektes „Mausgehirnstecker“ (Projektträger FZ Jülich). Unser Konzept: Ein System zur optischen An- und Abregung wird in einem „Zylinder“ auf dem Kopf der Maus untergebracht. Zudem befinden sich in diesem „Zylinder“ ein Vorverstärker und eine Positioniereinheit mit Getriebe und Motor. Vom „Zylinder“ aus werden die Daten der elektrischen Nervensignale an einen „Rucksack“ per Kabel übermittelt, dort verarbeitet und dann über Funk an den Auswertungsrechner geschickt (Abbildung 1).

Ein System zur optischen An- und Abregung kombiniert mit einer elektrischen Vermessung wird als Optoelektrodensonde (kurz: Optrode) bezeichnet. Eine Optrode hat also zwei Aufgaben: Erstens soll sie Licht ins Gehirn leiten und die Nerven stimulieren, zweitens soll sie die daraus resultierenden elektrischen Potentiale messen. Wir stellen die Optrode aus Silizium her; sie enthält eine Glasfaser, eine LED und - an der Spitze - 16 Elektroden (Abbildung 2).

Abbildung 3 zeigt die fertiggestellte Optrode mit der Glasfaser, den Kontaktpads, den Zuleitungen zu den Elektroden sowie der eingeklebten LED.

In Abbildung 4 sieht man, wie das Licht aus der Optrodenspitze austritt. 

Die elektrische Funktion der Optrode wurde in ersten Tests untersucht. Hierbei zeigte sich, dass die Optrode Signale messen kann, die von einer nahegelegenen Signalelektrode aus gesendet wurden – und das in hoher Präzision (Abbildung 5).

Datenübertragung

Die elektrischen Signale der Nervenzellen sollen mit der Optrode aufgenommen, über einen AD Wandler an einen Mikrocontroller im „Rucksack“ geleitet und dann telemetrisch an die Basisstation übertragen werden. Die Elektronik für die Datenverarbeitung und Übertragung wurde in zwei Blöcke unterteilt (Abbildung 6). 

Die „Basisstation“ ist ein stationärer PC, der über eine Funkübertragung mit dem mobilen Block auf der Maus kommuniziert. Der mobile Block besteht aus dem „Zylinder“ auf dem Kopf der Maus und dem „Rucksack“. „Zylinder“ und „Rucksack“ sind über ein Kabel verbunden. Die Komponenten im „Zylinder“ - Mikromotor, Vorverstärker und Optrode - werden über einen Mikrocontroller angesteuert, der sich im „Rucksack“ befindet. Neben dem Mikrocontroller sind auch eine Funkübertragungseinheit und eine Batterie zur Energieversorgung im „Rucksack“ untergebracht. Wichtige Kriterien an die Elektronik des mobilen Blocks sind Größe und Gewicht der Bauteile. Zugleich sollen an den 16 Messpunkten der Optrode eine Übertragungsrate von 10 kHz und eine Auflösung von 12 Bit gewährleistet sein. Falls die Bandbreite der Funkübertragung für die anfallende Datenmenge nicht ausreichen sollte, planen wir, eine μSD-Karte zur Zwischenspeicherung der Daten einzusetzen. Diese würde dann ebenfalls im „Rucksack“ untergebracht werden. Die einzelnen Komponenten für die elektronische Motorsteuerung wurden erfolgreich getestet (Abbildung 7 a).

Der "Zylinder"

Die Optrode soll insgesamt maximal 3,6 mm tief in das Gehirn der Maus eingefahren werden, in der Endphase mit ca. 20 μm pro Tag. Dafür verwenden wir einen Mikromotor mit Getriebe und Spindel. Der Motor wird von dem externen Rechner telemetrisch angesteuert. Dadurch kann die Optrode kontrolliert und schonend in das Mausgehirn eingeführt werden. Die gesamte Messeinheit ist im „Zylinder“, einem Gehäuse aus Titan, untergebracht (Abbildungen 8 und 9).

Das Gehäuse wird auf einem Sockel befestigt. Der Sockel wird stereotaktisch auf dem Mausschädel justiert und dann mit Zahnzement festgeklebt.

Ausblick

In der EU leiden ca. 8 Millionen Menschen an Epilepsie. Unsere Forschungs- und Entwicklungsarbeiten sollen helfen, Fragen des komplexen Zusammenspiels der Neuronen zu beantworten, um so mittelfristig die Behandlung mit Medikamenten patientenspezifischer durchführen und langfristig - als Vision - vielleicht sogar einen „Gehirnschrittmacher“ entwickeln zu können. Auf dem Weg zu diesem Ziel konnten wir grundlegende technologische Fragen klären. Weiterführende Arbeiten sind im Rahmen eines EU Projekts (Era-Net NEURON; Projektträger DLR, Bonn) mit weiteren Partnern aus Spanien, Frankreich und Israel geplant.

Referenzen:

[1] Nagel, G., Ollig, D., Fuhrmann, M., Kateriya, S., Musti, A.-M., Bamberg, E., and Hegemann, P. (2002) “Channelrhodopsin-1, A Light-Gated Proton Channel in Green Algae” Science 296, 2395-2398
[2] Nagel, G., Szellas, T., Huhn, W., Kateriya, S., Adeishvili, N., Berthold, P., Ollig, D., Hegemann, P., and Bamberg, E. (2003) “Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel” Proc. Natl. Acad. Sci. 100, 13940-13945
[3] Li, X., Gutierrez, D.V., Hanson, M.G., Han, J., Mark, M.D., Chiel, H., Hegemann, P., Landmesser, L.T., and Herlitze, S. (2005) “Fast noninvasive activation and inhibition of neural and network activity by vertebrate rhodopsin and green algae channelrhodopsin” Proc. Natl. Acad. Sci. 102, 17816-17821
[4] Boyden, E.S., F. Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., and Deisseroth, K. (2005) “Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity” Nature Neuroscience 8, 1263-1268
[5] Zhang, F., Wang, L., Brauner, M., Liewald, J. F., Kay, K., Watzke, N., Wood, P. G., Bamberg, E., Nagel, G., Gottschalk, A., and Deisseroth, K. (2007) “Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry” Nature 446, 633-639
[6] Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J.F., Adeishvili, N., Bamberg, E., and Gottschalk, A. (2005) “Lightactivation of Channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses” Current Biology 15, 2279-2284
[7] Remy, S., Csicsvari, J., and Beck, H. (2009) “Activity-dependent control of neuronal output by local and global dendritic spike attenuation” Neuron 61, 906-916
[8] Otte, D.M., Bilkei-Gorzó, A., Filiou, M.D., Turck, C.W., Yilmaz O., Holst, M.I., Schilling, K., Abou-Jamra, R., Schumacher, J., Benzel, I., Kunz, W.S., Beck, H., and Zimmer, A. (2009) “Behavioral changes in G72/G30 transgenic mice” Euro. Neuropsychopharmacol. 19, 339-348
[9] Wiese, C., Rolletschek, A., Kania, G., Navarrete-Santos, A., Anisimov, S.V., Steinfarz, B., Tarasov, K.V., Brugh, S.A., Zahanich, I., Rüschenschmidt, C., Beck, H., Blyszczuk, P., Czyz, J., Heubach, J.F. Ravens, U., Horstmann, O., St-Onge, L., Braun, T., Brüstle, O., Boheler, K.R., and Wobus, A.M. (2006) “Signals from embryonic fibroblasts induce adult intestinal epithelial cells to form nestin positive cells with proliferation and multilineage differentiation capacity in vitro” Stem Cells 24, 2085-2097
[10] Remy, C., Remy, S., Beck, H., Swandulla, D., and Hans, M. (2004) “Modulation of voltagedependent sodium channels by the delta-agonist SNC80 in acutely isolated rat hippocampal neurons” Neuropharmacology 47, 1102-1112